党参Codonopsis pilosul (Franch.) Nannf属植物全世界约有40种，中国约有39种(冯佩佩等, 2012)。中药党参为桔梗科多年生草本植物党参、素花党参、川党参及其同属多种植物的根。党参为中国常用的传统补益药，具有补中益气、润肺生津的功效，用于气血两虚、气短心悸、食少心悸、食少便溏、嘘喘咳嗽和内热消渴等(朱恩圆等, 2001)。传统使用中以山西上党地区出产的党参为上品，具有补中益气，健脾益肺之功效。现代研究表明党参含有多糖、皂苷、生物碱、黄酮、挥发油等多种天然药理活性(汪建红等, 2001)。现代药理学研究证实党参具有抗肿瘤，抗放射，增强免疫功能及抗氧化等多种生物活性，其主要活性成分为党参多糖(Wang et al., 1996; Huheihel et al., 2002; Sun and Liu, 2008, 杨丰榕等, 2011; 杨维群等, 2015)。近几年，国内外在党参多糖生物活性方面进行了深入的研究，但是有关党参多糖的结构研究报道的较少。

在党参粗多糖抗疱疹病毒的筛选期间, 我们发现分子量在3 000~10 000 kD硫酸化的粗多糖是有效果的(王欢等, 2015)。为了更好的探讨它抗病毒的作用机制，我们必须明确它的结构。本研究通过直接水解党参多糖COP-1，然后直接进高效液相分析，与标准单糖对照，从而解析单糖的组份及摩尔比；同时，结合IR数据，借助于一维和二维的核磁技术确定COP-1的结构。

1结果和分析

1.1分离与纯化

通过水提醇沉得方法得到浅黄色的粗多糖，然后用Sevag法除去蛋白质，接着流动自来水透析48 h,然后浓缩透析液并冷冻干燥。为了得到纯度较高的多糖，粗多糖(COP)先过Sephacryl S-200HR柱色谱。洗脱曲线表明COP呈现了一个大峰(COP-1) (图1A)，COP-1的进一步纯化在Sephadex G-25柱色谱，从洗脱曲线看，也只有一个峰(图1B)。

1.2多糖均一性和分子量的测定

在HPGPC凝胶色谱中COP-1呈现出一个对称的单峰，表明它是一个均一的多糖。根据分子量的标准曲线：logM=2.544+0.6998X-0.0473X2,然后计算得出均一多糖(COP-1)重均分子量为：2.1×10³ Da。

1.3单糖组分分析

COP-1单糖组成是通过直接水解多糖样品，然后进高效液相色分析的。单糖和多糖水解的高效液相色谱图(图3; 图4)。多糖水解液的出峰时间对比单糖，可以得知COP-1主要由果糖组成。

1.4 COP-1红外分析

COP-1多糖的红外光谱反映了它们的官能团和化学键(图5)。吸收峰3 200 cm^-1~3 500 cm^-1的响应是被-OH的拉伸振动引起的。在2 939 cm^-1的吸收是由于-CH的拉伸振动，同时1 637 cm^-1的信号是由二氧化碳引起的。吸收在附近934 cm^-1，872 cm^-1和818 cm^-1的信号表示存在呋喃环的构型，也表明COP-1是呋喃型糖苷键(肖雄等, 2015)；此外，对于1 620 cm^-1~1 550 cm^-1没有吸收峰证明缺乏氨基。同时在1 077 cm^-1和1 099 cm^-1的峰均属性与OH的角振动的变化。我们从吸收在872cm^-1，818 cm^-1处推断出该多糖构型是β-D-呋喃果糖(许峰等, 2014)。在1 740 cm^-1没有吸收，提示我们COP-1结构中没有糖醛酸。

1.5 COP-1核磁分析

COP-1的氢谱(图6A, D2O作溶剂)显示有7个低场质子信号：δH 4.23 (d, J = 8.3 Hz, 1H)、4.07 (t, J = 8.3 Hz, 1H)、3.90 (d, J = 10.1 Hz, 1H)、3.83 (m, 2H)、3.72 (m, 2H)；COP-1的氢谱(图6B, DMSO-d6做溶剂)出现三个羟基的信号：δH 5.18 (d, J = 4.5 Hz, 1H)、4.75 (d, J = 5.6 Hz, 1H)、4.62 (s, 1H)。在COP-1碳谱(图6C)和HSQC (图6D)中出现了6个碳原子，包括一个季碳信号(δC 103.1)，三个叔碳的信号(δC 80.9, 76.8, 74.1)，两个仲碳信号(δC 62.0, 60.7)，通过对比文献(叶冠等, 2005)糖单元的结构被推断为呋喃型的果糖。呋喃果糖的异头碳信号(δC 103.1)表明糖环的构型是β构型。在HMBC图谱中(图6E, DMSO-d6做溶剂)体现了-OH和-C的相关性(图7)：OH-3和C-2、C-3、C-4有相关；OH-4和C-3、C-4、C-5有相关；OH-6和C-5、C-6有相关，表明OH-1和OH-2的羟基参与糖苷键的形成。最终我们确定多糖COP-1的结构如下：

[→1)- β-D-fru-(2→1) -]n

2讨论

从党参中分离出的水溶性果聚糖经IR、1H-NMR、13C-NMR、HMBC和HMQC等核磁图谱，推断COP-1的结构是：→1)- β-D-fru-(2→1)。另外，我们分析该多糖的单糖组分时没有采取衍生化的方法，而是将水解样品进高效分析。采用非衍生化的方法，可以避免不同单糖之间的相互转化，同时，减少操作步骤以降低人为误差(这是一种精确的方式分析单糖组成，原因是不经过衍生化就不会有样品的损失)。此外，果糖在碱性条件下会发生结构的转变，转变成葡萄糖和甘露糖(Fu and O’Neill, 1995)，假设某种多糖的单糖组成中含有果糖，葡萄糖、甘露糖(或者是其中的一种)，这样子的话会不利于单糖的组成分析。IR和核磁(包含2DNMR)技术相互结合推测出COP-1结构。

3材料与方法

3.1实验材料

洛龙党参购于遵义市道真县，经遵义医学院杨建文教授鉴定为：Codonopsis pilosul (Franch.) Nannf。甲醇、乙醇、三氟乙酸、葡萄糖、正丁醇等购自于成都市科伦化工试剂厂；硝酸钠购于上海化学试剂总厂；氯化钠，D-甘露糖，D-(+)-木糖，D-(-)果糖购自国药集团化学试剂有限公司(均为分析纯)；二甲亚砜、D2O (色谱纯)、KBr (光谱纯)、普鲁兰多糖(分子量: 1 000 Da, 5 000 Da, 12 000 Da, 25 000 Da, 50 000 Da)等购自于SIGMA-ALDRICH公司。

3.2粗多糖的分离纯化

100 g粗多糖溶于100 mL去离子水，1 580 (×g)离心10 min除去不溶物。加入无水乙醇使多糖溶液中乙醇终浓度为35％，然后将其存储在4℃下两周。两周后在烧杯的底部，出现了白色沉淀，冷冻干燥得到白色粉末。称取1 g白色粉末溶解在30 mL去离子水，然后用10 mL Sevag试剂(正丁醇:氯仿=1:4)溶液中重复加入三次去除蛋白质组分。取制得白色粉末粗多糖0.5 g溶解在10 mL去离子水中，上Sephacryl S-200HR (2.6×140 cm, Whatman)柱，0.2 mol/L NaCl等度洗脱，恒流泵流速：0.6 ml/min，然后用硫酸苯酚法跟踪检测，收集主峰溶液，透析，浓缩。进一步的纯化通过Sephadex G-25 (2.6×50 cm, Whatman)柱，用去离子水洗脱以0.3 mL/min的流速洗脱。收集主峰，透析，并冻干，命名为COP-1。

3.3多糖COP-1均一性和分子量确定

1 mg纯化的COP-1溶解在1 mL去离子水中，8 827 (×g)离心5 min，收集上清液，待上HPLC分析。HPGPC的具体测试条件如下：Agilent高效液相系统(1 260 HPLC Pump, In line Degasser, 1 260 Infinity Refractive Index Detector, Waters Ultrahydrogel 250 (7.8×300 mm)色谱柱，流动相：0.2 mol/L硝酸钠，流速：0.6 mL/min，进样体积：20 μL，柱温：30℃(姚晓东等, 2015)。

3.4多糖COP-1组分分析-HPLC法

取约1 mg COP-1置于安瓿瓶中，加入1.5 mL的2 mol/L的三氟乙酸，然后封管在100℃的条件下水解3 h (Hu et al., 2015)。接着用旋转蒸发仪旋干水解液，加入1 mL的甲醇接着旋蒸除去多余的三氟乙酸。然后用1 mL去离子水复溶，8 827 (×g)离心5 min，并收集上清液。色谱分析条件如下：Agilent高效液相系统(1 260 HPLC Pump, In line Degasser, Evaporative Light-scattering Detector, Xbridge BEH Amide (4.6×250 mm)色谱柱，流动相：A- 80%乙腈水溶液含0.2%三乙胺;B-30%乙腈水溶液含0.2%三乙胺，ELSD检测器漂移管的温度：30℃,雾化温度：30℃，梯度洗脱程序：A 100%~40%~100%，0~21.00~33.00 min，进样体积：20 μL，柱温：35℃。

3.5红外分析

将适量的多糖COP-1和KBr置于105°C条件下干燥6 h，为了除去这两种物质中的水分，以便更好地分析多糖的结果。在研钵中加入2 mg的多糖样品和400 mg已经烘干的KBr充分研磨。然后进行压片扫描分析，扫描波长范围在500~4 000 cm^-1。

3.6核磁分析

核磁是一种很有效的工具用来分析多糖的复杂结构，可以提供精确的信息，包括单糖组成、连接方式、糖环的构型等。室温下取100 mg COP-1分别用了99.9% DMSO和99.96% D2O溶解，如不能完全溶解，则需要加热使其全部溶解。运用Agilent Technologies 400/54 Annual Refill扫描分析。

作者贡献

刘章泉负责试验操作及文章撰写；姚晓东负责文章校对，实验辅助；肖世基负责文献实验技术指导和核磁图谱的解析；陈晓兰、吴倩男负责文献查阅；余兰负责实验路线设计和文章修改。

致谢

本研究由遵义医学院博士启动资金协助项目(ZMKD2013-006)和贵州省自然科学基金(QKH-LH[2014]7563)共同资助。

参考文献

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